微小核酸 miRNA qPCR定量分析
miRNA Expression qPCR Analysis
說明
- microRNA為19-22nt的短的非编碼RNA。
- 與mRNA的3'-UTR區域結合，進而在轉錄後調控mRNA的表達。
- 在不同物種中，miRNA 序列具有高度的保守性 ( Conserved )，具有組織特異性。
- microRNA的表達改變與目前各種已知疾病相關。
原理
● 採用廣泛認可的Stem-loop法，其包含miRNA特異的反轉錄引物，以及qPCR正、反向引子。環狀結構的miRNA特異反轉錄引物可特異性的轉錄mature miRNA。再利用高度特異的正反向引子，使miRNA定量既靈敏又具高度特異。
● 提供miRNA spike-in，以監控miRNA純化過程是否有較大損失和反轉錄與定量PCR是否有PCR抑制劑。
實驗範例
miRNA檢測範例
圖1. qPCR檢測MCF Cell 中miRNA-21-5p的表達情況
送檢服務注意事項
--所需樣品種類：細胞株，動物組織類，植物組織類等等。
--樣品須為非感染性生物。
由於 RNA 在環境中 非常容易降解
後續 要執行RNA實驗 建議 以下方式 收檢
動物犧牲 立即 將 組織 以 RNA Keeper(RNAlater) 收樣保存
愈新鮮狀態 放至 RNA Keeper中, 愈能保護當下 RNA品質狀態
(1份樣本體積與4份RNA Keeper 均質混合，可穩定保存於4度C一周內)
--樣品須為非感染性生物。
由於 RNA 在環境中 非常容易降解
後續 要執行RNA實驗 建議 以下方式 收檢
動物犧牲 立即 將 組織 以 RNA Keeper(RNAlater) 收樣保存
愈新鮮狀態 放至 RNA Keeper中, 愈能保護當下 RNA品質狀態
(1份樣本體積與4份RNA Keeper 均質混合，可穩定保存於4度C一周內)
--收件方式
線上加入 LINE ID : @topgen
| 細胞收檢 參考流程: | |
| 步驟 | 內容 |
| 1 | 細胞先以PBS Wash 1次 |
| 2 | 加入至少 ~500ul RNA Keeper(RNAlater) |
| 3 | 利用細胞刮杓將細胞分離(Gently) |
| 4 | 利用pipetman將細胞至於 Eppendorf |
| 5 | 加入fresh 500ul PBS至於 Eppendorf |
| 6 | 離心 (3,000rpm, 3min), 使細胞沉降下來 |
| 7 | 移除上清液, 加入fresh 500ul RNA Keeper(RNAlater) |
| 8 | 於4°C 或室溫 保存 2hrs以上(此步驟, 為了能讓RNA Keeper浸潤細胞完全。請避免直接丟冷凍, 會導致細胞破裂, 影響後續RNA品質) |
| 9 | 反應完後, 可冷凍-20°C保存 |
| 組織收檢 參考流程: | |
| 步驟 | 內容 |
| 1 | 將組織剪切至米粒般大小 (浸潤效果較佳) |
| 2 | 加入 ~500ul RNA Keeper(RNAlater) |
| 3 | 於4°C 或室溫 保存 1hrs 以上(此步驟, 為了能讓RNA Keeper浸潤細胞完全。請避免直接丟冷凍, 會導致細胞破裂, 影響後續RNA品質) |
| 4 | 反應完後, 可冷凍-20°C保存 |
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